污泥-廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵培養(yǎng)Bt 生物殺蟲(chóng)劑

    本文考察了城市污泥與廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌（Bt）生物殺蟲(chóng)劑的可行性。作為污泥發(fā)酵的補(bǔ)充碳源，廢糖蜜添加比例低于2.0%（質(zhì)量比）時(shí)，對(duì)Bt的生長(zhǎng)、代謝、晶體蛋白合成以及毒效有良好的促進(jìn)作用，當(dāng)添加比例高于2.0%時(shí)則表現(xiàn)出抑制作用。通過(guò)改變廢糖蜜添加比例，獲得污泥與廢糖蜜的最佳配比：即在含固率為3%的污泥中添加1.5%的廢糖蜜。此配比對(duì)Bt生長(zhǎng)最為有利，活菌數(shù)與活芽孢數(shù)最大值可分別達(dá)到4.17×108和3.60×108CFU/ml，發(fā)酵48h后，發(fā)酵液中晶體蛋白產(chǎn)量約為1.96mg/ml，毒效788IU/μL，高于其他復(fù)配培養(yǎng)基。此外，本研究表明，晶體蛋白產(chǎn)量和發(fā)酵液生物毒效有顯著相關(guān)性，晶體蛋白含量可作為一種簡(jiǎn)單可靠的Bt發(fā)酵性能表征指標(biāo)，在Bt生產(chǎn)中有一定實(shí)用價(jià)值。
    【關(guān)鍵詞】城市污泥; 廢糖蜜; 晶體蛋白; 殺蟲(chóng)毒效

    蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thurngiensis，簡(jiǎn)稱Bt）是一類能在代謝過(guò)程中產(chǎn)生伴孢晶體（殺蟲(chóng)晶體蛋白）的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其伴孢晶體蛋白對(duì)600多種害蟲(chóng)有殺蟲(chóng)活性，其制劑已被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于防治農(nóng)林害蟲(chóng)、貯藏害蟲(chóng)以及醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)。Bt制劑具有高效低毒、環(huán)境安全、對(duì)害蟲(chóng)特異性強(qiáng)、不殺傷害蟲(chóng)天敵等諸多優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)今世界上產(chǎn)量最大的生物殺蟲(chóng)劑，占生物殺蟲(chóng)劑全球總銷售額的90%以上。目前Bt殺蟲(chóng)劑主流生產(chǎn)工藝是液體深層發(fā)酵，主要以各種工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品或農(nóng)副產(chǎn)品，如葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、黃豆粉、玉米淀粉、花生餅粉，麥麩等為原料，原料成本約占總成本的35%-59%，是生物殺蟲(chóng)劑難于普及的主要限制因素之一。為降低Bt生產(chǎn)的原料成本，提高其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，從廢棄資源再利用的角度出發(fā)，已有研究提出以城市污泥為原料發(fā)酵生產(chǎn)Bt生物殺蟲(chóng)劑。
    然而，我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，單一污泥培養(yǎng)Bt，發(fā)酵水平較低，發(fā)酵液殺蟲(chóng)活性不高。究其原因，可能是污泥中可利用碳源不足。廢糖蜜是制糖業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物，含有豐富的微生物可利用碳源（還原糖占總糖量的60%-80%），目前主要用于發(fā)酵制酒精，產(chǎn)品附加值不高且產(chǎn)生的廢水為高污染。本文將廢糖蜜用作污泥發(fā)酵的補(bǔ)充碳源，通過(guò)優(yōu)化污泥與廢糖蜜配比來(lái)改善Bt’發(fā)酵過(guò)程（菌體增殖、芽孢形成與晶體蛋白合成），提高發(fā)酵液殺蟲(chóng)毒效。

   1 材料與方法
　　1.1 菌種
　　蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki 130-1, 四川師范大學(xué)胡佩博士惠贈(zèng), 本實(shí)驗(yàn)室保藏。

　　1.2 供試材料
　　1.2.1 城市污泥
　　采自北京高碑店污水處理廠, 為未經(jīng)消化的濃縮污泥, 理化性質(zhì)見(jiàn)表1。采回置于4 ℃ 冰箱中保存, 待與廢糖蜜復(fù)配。
　　1.2.2 廢糖蜜
　　俗稱桔水,采自南寧,褐色,粘稠狀, 4℃ 冰箱保存。經(jīng)分析, 含固率約為70%, pH = 4190, 還原糖含量562.3 g/kg , 粗蛋白15.7 g/kg。

　　1.3 培養(yǎng)基
　　(1)固體培養(yǎng)基, 即BP 培養(yǎng)基( g/L) : 牛肉膏510, 蛋白胨10.0, NaCl 5.0, 瓊脂粉15.0, pH 7.2;
　　(2)液體培養(yǎng)基: 固體培養(yǎng)基成分中除去瓊脂粉, 用作種子培養(yǎng)基;
　　(3)發(fā)酵培養(yǎng)基: 污泥與廢糖蜜復(fù)配, 隨廢糖蜜添加比例的不同, 分為6 個(gè)處理, 編號(hào)A--F( A: 原污泥; B: 污泥+0.5% 廢糖蜜; C: 污泥+ 1.0% 廢糖蜜;D: 污泥+ 1.5% 廢糖蜜; E: 污泥+ 2.0% 廢糖蜜; F:污泥+ 2.5%廢糖蜜) , 混勻后用4mol/L的NaOH和HCl 調(diào)節(jié)pH, 使滅菌后pH 在7.0 左右。
　　1.4 接種物
　　250mL 錐形瓶?jī)?nèi)盛50mL Bp液體培養(yǎng)基, 從斜面培養(yǎng)基中移取一環(huán)Bt 接種,于( 30±1) ℃和200/min往復(fù)式搖床培10h。預(yù)試驗(yàn)表明, 此時(shí)Bt處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 是接種的適宜時(shí)期。
　　1.5 搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)
　　500mL 錐形瓶?jī)?nèi)盛100mL 各組合發(fā)酵培養(yǎng)基,移取2% ( 體積比) 上述接種物。接種后于( 30±1)℃, 200 r/min的往復(fù)式搖床培養(yǎng)48h, 每隔3h 移取發(fā)酵液3mL, 測(cè)定pH、活菌數(shù)及活芽孢數(shù)。至48 h發(fā)酵完成時(shí)用25%磷酸調(diào)節(jié)pH 至5.0-5.5, 待測(cè)晶體蛋白含量及殺蟲(chóng)毒效。
　　1.6 分析方法
　　活菌數(shù)( VC) 與活芽孢數(shù)( VS) : 采用無(wú)菌操作,將發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋, 取適宜稀釋度的菌液涂布平板, 于30℃恒溫培養(yǎng)16~-18h 后計(jì)活菌數(shù); 對(duì)于活芽孢數(shù), 需將適宜稀釋度的菌液于80℃水浴處理15min, 然后進(jìn)行涂布培養(yǎng)計(jì)數(shù), 每平板菌數(shù)在30-300 CFU( Colony forming unit, 菌落形成單位) 內(nèi)有效。晶體蛋白含量測(cè)定: 按照《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》GB/T 19567.3-2004 中的SDS-PAGE 洗脫比色法測(cè)定晶體蛋白含量, 以130000 Da作為測(cè)定條帶。
    殺蟲(chóng)毒效生物測(cè)定: 根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《蘇云金芽孢桿菌懸浮劑》GB/T 19567.2-2004 對(duì)產(chǎn)品毒效進(jìn)行生物測(cè)定。以小菜蛾( Plutella xylostrella ) 為標(biāo)準(zhǔn)供試蟲(chóng)種, 以湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物農(nóng)藥工程中心提供的CS-1991 (H3a3b) 為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照( 標(biāo)準(zhǔn)品毒力效價(jià):55 000 IU/mg) , 按照標(biāo)準(zhǔn)化程序進(jìn)行毒力效價(jià)測(cè)定。數(shù)據(jù)采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA 方差分析, 兩兩比較采用t 檢驗(yàn)。

　　2 結(jié)果與討論
　　2.1 生長(zhǎng)代謝狀況
　　Bt 是一類化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌, 只能利用有機(jī)含碳化合物作為碳源和能源。自然界的含碳化合物種類繁多, 并非都能被Bt 利用, 常用作碳源的主要是糖類。城市污泥中總碳含量高達(dá)30%-40% ,但易為Bt 同化利用的還原糖、淀粉等在碳源中所占比例很低, 不超過(guò)污泥干重的3%。因此以污泥作為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí), Bt 往往因碳素營(yíng)養(yǎng)不足而過(guò)早進(jìn)入穩(wěn)定期 , 導(dǎo)致發(fā)酵液中活菌數(shù)較低, 限制了后續(xù)的芽孢形成與晶體蛋白合成, 從而降低了發(fā)酵液的生物毒效。針對(duì)污泥可利用碳源不足, 本研究考察了污泥-廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵, 通過(guò)逐步提高廢糖蜜添加比例, 形成了一系列復(fù)配培養(yǎng)基。搖瓶發(fā)酵48h, 過(guò)程中VC、VS 與pH 的動(dòng)態(tài)變化如圖1 所示。
　　觀察圖1 , 當(dāng)采用含固率為3% 的污泥作為唯一培養(yǎng)基時(shí), 菌體生長(zhǎng)的指數(shù)期較短, 活菌數(shù)增幅較小, 發(fā)酵6hVC 出現(xiàn)第一次峰值, 僅有6.33×107CFU/mL , 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同期污泥-廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵的結(jié)果, 而后進(jìn)入芽孢形成期, 受指數(shù)期菌體大量增殖的影響, 此時(shí)培養(yǎng)基中溶解氧處于較低水平, 菌體的穩(wěn)定性及菌落形成能力較差 ,VC 值下降明顯,盡管發(fā)酵后期迅速上升, 活菌數(shù)還是受到一定影響,VC 最大值出現(xiàn)在36h, 為2.57 ×108CFU/mL。而從VC 曲線比較可以看出, 在0%-2.5% 的廢糖蜜添加比例范圍內(nèi), 污泥-廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵明顯優(yōu)于污泥本身, 且隨著廢糖蜜比例的提高, 指數(shù)期持續(xù)時(shí)間加長(zhǎng), 活菌數(shù)也明顯增加。例如, 添加2.5% 廢糖蜜的培養(yǎng)基發(fā)酵9h 時(shí), VC 值可達(dá)5.46 ×108CFU/mL , 是同期污泥單獨(dú)發(fā)酵的9 倍。另外, 廢糖蜜的添加也改善了芽孢形成初期VC 值回落的現(xiàn)象, 有利于緩解曲線的/ 雙對(duì)數(shù)現(xiàn)象。添加1.5% 廢糖蜜的培養(yǎng)基VC 值僅有輕度回落, 且持續(xù)時(shí)間較短, 說(shuō)明適量增加污泥中的還原糖含量有利于提高芽孢形成期菌體的穩(wěn)定性。至發(fā)酵終點(diǎn)( 48h) , 最高VC 值出現(xiàn)在F 處理( 污泥+ 2.5% 廢糖蜜) , 約為2.95 ×108CFU/mL, 比不加糖蜜的單一污泥發(fā)酵( 1.80×108CFU/mL) 高出63.9%。
    進(jìn)一步觀察圖1( b) 可以發(fā)現(xiàn), 當(dāng)廢糖蜜添加比例≤2.0% 時(shí), 芽孢的形成在12-18 h 最旺盛, 發(fā)酵24 h 時(shí)抗熱性芽孢已基本成熟, 此時(shí)用晶體與芽孢區(qū)別染色法可明顯觀察到菌體的一端為染成藍(lán)色的晶體, 另一端是無(wú)色透明的芽孢。當(dāng)糖蜜添加比例> 2.0%時(shí), 由于碳素含量過(guò)高, 芽孢的形成明顯延滯, 48 h 才能觀察到成熟的芽孢和晶體, 并且數(shù)量只有9.0×107CFU/mL 。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,VS 最大值出現(xiàn)在添加1.5% 廢糖蜜的培養(yǎng)基發(fā)酵24 h 時(shí), 約為3.6 ×108CFU/mL。

　　圖1( c) 顯示了廢糖蜜添加比例對(duì)Bt 發(fā)酵液pH變化的影響。隨廢糖蜜添加比例的提高, 糖代謝引起的pH 下降程度明顯加強(qiáng), 持續(xù)時(shí)間也逐漸增長(zhǎng)。特別是廢糖蜜添加比例為215% 的處理, pH 可持續(xù)降至最低值6.10, 培養(yǎng)基長(zhǎng)期處于低pH 水平, 可能對(duì)菌體代謝產(chǎn)生負(fù)面影響, 致使芽孢形成延遲, 發(fā)酵周期延長(zhǎng)。綜上所述, 作為污泥發(fā)酵培養(yǎng)Bt 的補(bǔ)充碳源,廢糖蜜的添加比例為1.5% ( 質(zhì)量比) 時(shí), 對(duì)Bt 生長(zhǎng)代謝最為有利, 發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)與活芽孢數(shù)最大值可分別達(dá)到4.17×108和3.603.6 ×108CFU/mL。
　　2.2 晶體蛋白產(chǎn)量
　　Bt 的主要?dú)⑾x(chóng)活性物質(zhì)是伴孢晶體( 晶體蛋白, 簡(jiǎn)稱Cry) 。在昆蟲(chóng)中腸堿性條件下, Cry 被降解為毒性蛋白肽, 破壞中腸上皮細(xì)胞, 同時(shí)芽孢侵入增殖, 導(dǎo)致昆蟲(chóng)痙攣或敗血癥而死 。Cry 的合成受培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件的影響顯著。對(duì)上述各復(fù)配培養(yǎng)基48 h 的發(fā)酵終產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE 電泳, 并與高分子量蛋白Marker 進(jìn)行對(duì)照( 如圖2 所示) , 經(jīng)計(jì)算該菌株的晶體蛋白分子量在約為130000 Da, 是對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)有毒效的特征蛋白。圖2 同時(shí)也直觀地顯示了不同添加比例的廢糖蜜對(duì)發(fā)酵液中晶體蛋白含量的影響, 當(dāng)廢糖蜜添加比例< 210%時(shí), 隨著添加比例的提高, 蛋白帶變寬變深,說(shuō)明適量添加碳源有利于晶體蛋白合成與積累; 繼續(xù)添加廢糖蜜( > 2.0% ) 時(shí), 晶體蛋白帶明顯變淺, 說(shuō)明過(guò)多的碳源抑制了晶體蛋白合成。

　　進(jìn)一步割膠比色, 并將吸光值代入同步操作的標(biāo)準(zhǔn)晶體蛋白回歸方程( y = 124.224x + 4.12924,R = 0.997, 其中x-ABS, y-Cry/mg/mL) , 得到不同復(fù)配培養(yǎng)基發(fā)酵終點(diǎn)的晶體蛋白含量, 如圖3 所示。A-F 6 組間的方差分析結(jié)果顯示, 除C 與E 兩組間蛋白含量無(wú)顯著差異外, 其余各組兩兩間均存在顯著性差異( P < 0.01) 。這說(shuō)明適當(dāng)添加廢糖蜜可顯著提高晶體蛋白產(chǎn)量, 添加1.5% 廢糖蜜時(shí)發(fā)酵液Cry 濃度最高, 達(dá)1196mg/mL。而繼續(xù)提高廢糖蜜添加比例至215% 時(shí), Cry 產(chǎn)量卻迅速降至0.28mg/mL, 推斷這是由于過(guò)量廢糖蜜導(dǎo)致發(fā)酵周期延長(zhǎng), 芽孢不易形成, 同時(shí)晶體蛋白的合成受到延滯或抑制。

　　2.3 生物毒力效價(jià)
　　實(shí)驗(yàn)以2齡末小菜蛾幼蟲(chóng)作為試蟲(chóng), 接蟲(chóng)感染48h 后發(fā)現(xiàn), Bt 發(fā)酵液對(duì)小菜蛾有明顯殺蟲(chóng)活性, 感染Bt 而死亡的昆蟲(chóng)可觀察到全身變黑、腐爛并萎縮, 死亡率與晶體蛋白濃度梯度顯著相關(guān), 具體數(shù)據(jù)如表2 所示。從表2 中可以看出, 除添加2.5%廢糖蜜的培養(yǎng)基外, 其他復(fù)配培養(yǎng)基LC50都在1μL/mL以下, 顯著低于單一污泥發(fā)酵的培養(yǎng)基, 且廢糖蜜最適宜的添加比例在1.0%-2.0%之間。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行代換, 得出48 h 各發(fā)酵液的毒效(Tx ) , 從中可以看出隨廢糖蜜添加比例的提高, 毒效呈階梯上升, 添加115%廢糖蜜的培養(yǎng)基毒效最高( 為788IU/μL) 。而繼續(xù)提高廢糖蜜添加比例毒效反而顯著下降, 與晶體蛋白含量反映的趨勢(shì)相同。

    2.4 晶體蛋白含量與生物毒效的相關(guān)性分析
　　生物毒效是表征發(fā)酵性能的最有效指針。但它的測(cè)定費(fèi)時(shí)費(fèi)力, 因此在Bt 生產(chǎn)中往往期望能用簡(jiǎn)單快速的方法( 例如芽孢數(shù)量或晶體蛋白含量) 來(lái)監(jiān)控發(fā)酵過(guò)程與產(chǎn)品質(zhì)量。事實(shí)上, 發(fā)酵液最終毒效是發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)體增殖、芽孢形成及晶體蛋白合成的綜合反映。正常生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)體是形成芽孢的基礎(chǔ), 而伴孢晶體的合成以芽孢形成為前提。圖4 分別反映了各培養(yǎng)基發(fā)酵48 h 時(shí)VS 與Tx、Cry 產(chǎn)量與Tx 的相關(guān)性。SPSS 分析結(jié)果顯示, VS 與Tx 的相關(guān)性不顯著( R = 01795, n = 6, P > 0105) ; 而Cry 產(chǎn)量與Tx 極顯著相關(guān)( R = 01971, n= 6, P < 0.01) , 說(shuō)明芽孢數(shù)量不能作為表征發(fā)酵液生物毒效的定量依據(jù), 而晶體蛋白含量可用作表征發(fā)酵性能的簡(jiǎn)單、可靠的方法, 大大縮短生物毒效測(cè)定周期與費(fèi)用, 在Bt 生產(chǎn)中有一定實(shí)用價(jià)值。

　　3 結(jié) 論
　　(1) 廢糖蜜是污泥發(fā)酵培養(yǎng)Bt 的良好補(bǔ)充碳源。適量添加廢糖蜜( ≤2.0% ) 可以改善發(fā)酵過(guò)程中Bt 生長(zhǎng)代謝狀況( 包括菌數(shù)增長(zhǎng)、芽孢形成與晶體蛋白合成) 與發(fā)酵液的生物毒效; 但當(dāng)廢糖蜜添加比例> 210%時(shí)明顯抑制發(fā)酵過(guò)程。
　　( 2) 以含固率3%的污泥為對(duì)照, 通過(guò)改變廢糖蜜添加比例得出污泥-廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵培養(yǎng)Bt 的最佳復(fù)配比例為: 污泥+ 1.5%廢糖蜜, 此時(shí)Bt 生長(zhǎng)最旺盛, 活菌落數(shù)與活芽孢數(shù)最大值可分別達(dá)到4.17×108CFU/mL和3.60×108CFU/mL , 晶體蛋白產(chǎn)量與殺蟲(chóng)毒效最高, 是污泥單獨(dú)發(fā)酵的3-4 倍。
　　( 3) 晶體蛋白產(chǎn)量與發(fā)酵液生物毒效有極顯著相關(guān)性, 可用作表征Bt 發(fā)酵性能的簡(jiǎn)單、實(shí)用、可靠的指標(biāo)。
　　(4) 本研究通過(guò)污泥-廢糖蜜聯(lián)合發(fā)酵生產(chǎn)Bt生物殺蟲(chóng)劑, 為兩種有機(jī)廢棄物的資源高值化利用提供了一條新的有用途徑。（本文搜集整理于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)之處，請(qǐng)聯(lián)系我們刪除。）